干細(xì)胞養(yǎng)成記

干細(xì)胞是怎樣“養(yǎng)出來(lái)"的？

一、清洗與分離：獲取富含MSC的“華通氏膠"組織

1、材料準(zhǔn)備

新鮮臍帶組織（最好在出生后36小時(shí)內(nèi)處理）

無(wú)菌PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）、無(wú)菌手術(shù)刀、無(wú)菌剪刀/鑷子、10cm無(wú)菌解剖皿、50ml離心管

2、去除雜質(zhì)

將臍帶置于無(wú)菌解剖皿中，用PBS反復(fù)沖洗，去除殘余血液及運(yùn)輸液體。

建議切割成約5cm的小段，便于后續(xù)操作。

3、分離血管與華通氏膠

在每一小段臍帶上縱向淺切一刀，注意不要切穿血管。

用鑷子輕輕扒開(kāi)臍帶，露出中央的兩條動(dòng)脈和一條靜脈。

用鑷子將血管連同包裹的白色膠狀組織（血管周圍的“華通氏膠"）分離出來(lái)。

小心操作，盡量避免損傷血管內(nèi)皮層，減少其他細(xì)胞污染。

4、剝離與切塊

剝離下來(lái)的“華通氏膠"組織，用剪刀/手術(shù)刀切成1~3mm見(jiàn)方的小塊，保持組織濕潤(rùn)，避免干燥。

組織塊可暫時(shí)放在含PBS的離心管中，靜置備用。

二、切割與鋪板：為細(xì)胞“安家"

1、準(zhǔn)備培養(yǎng)器皿

選擇適合的培養(yǎng)瓶（如T25、T75等），事先用適宜的細(xì)胞貼壁底物處理（常見(jiàn)為膠原或?qū)Ｓ觅N壁液），按說(shuō)明書(shū)比例稀釋并包被，室溫靜置2小時(shí)后備用。

2、移植組織塊

用寬口移液器或無(wú)菌鑷子，將1~3mm見(jiàn)方的華通氏膠組織塊均勻放置在培養(yǎng)瓶底部。

建議每瓶間距均勻，不要堆疊，確保每塊都有接觸瓶底的機(jī)會(huì)，有利于貼壁。

3、添加培養(yǎng)基

緩慢加入預(yù)熱好的間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，通常8~10ml/瓶（以T75為例），覆蓋組織塊但不宜太多，以免組織漂浮。

4、初期培養(yǎng)

放入37℃、5% CO?培養(yǎng)箱，靜置5~7天，期間不宜移動(dòng)，以便組織塊穩(wěn)定貼壁。

觀察培養(yǎng)基顏色，不宜wan全變黃或干涸，必要時(shí)可補(bǔ)充部分新鮮培養(yǎng)基。

三、培養(yǎng)與換液：細(xì)胞“爬出"與擴(kuò)散

1、首ci換液

培養(yǎng)5~7天后，大多數(shù)組織塊已牢固貼壁，可進(jìn)行“半量換液"：傾斜瓶體，用移液器吸走一半舊培養(yǎng)基，慢慢補(bǔ)充等量新鮮培養(yǎng)基。

輕操作，避免擾動(dòng)組織塊。

2、后續(xù)觀察

繼續(xù)培養(yǎng)，每3-5天換液一次。隨著時(shí)間推移（通常10-14天），會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞逐漸從組織塊“爬"出，鋪展在瓶底，數(shù)量逐漸增多。

3、細(xì)胞長(zhǎng)滿（融合度70~80%）時(shí)處理

細(xì)胞生長(zhǎng)速度根據(jù)組織塊數(shù)量、初始樣本質(zhì)量等因素略有不同。一般10~18天左右，細(xì)胞可達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)。

四、收獲與擴(kuò)增：獲得大量MSC

1、去除組織塊

先棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗瓶底，去除未貼壁的組織塊及漂浮細(xì)胞。

2、消化收獲

加入適量細(xì)胞消化液（如胰酶/膠原酶混合液），37℃孵育6~8分鐘。

輕輕拍打瓶壁，顯微鏡下觀察，細(xì)胞開(kāi)始脫落。

3、終止消化與收集

加入等體積含血清或?qū)Ｓ孟K止液終止反應(yīng)。

用細(xì)胞濾網(wǎng)（70μm）過(guò)濾，收集單細(xì)胞懸液，棄去殘余組織塊。

4、離心與再接種

300g離心10分鐘，棄上清，PBS重懸。

細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1500~3000個(gè)/cm2密度接種到新培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)擴(kuò)增。

2-3天后細(xì)胞可達(dá)70-80%融合度，再進(jìn)入下次傳代。